سیدعلی خامنه‌ای در روز 24 تیر ماه سال 1318 (برابر با 28 صفر 1358 و 16 ژوئیه 1939) در شهر مشهد در ایران به دنیا آمد. پدرش سید جواد خامنه‌ای و پدربزرگش سید حسین خامنه‌ای از روحانیون آذربایجانی مقیم نجف و جدش اهل تفرش و مهاجر به آذربایجان بود.
عمه او همسر شیخ محمد خیابانی بود.
سید علی خامنه‌ای متأهل و دارای 6 فرزند است. همسر وی «خجسته» نام دارد. نام دخترانش بشری و هدی، و نام پسرانش مجتبی، مصطفی، مسعود و میثم است.
یکی از دختران وی همسر فرزند محمدی گلپایگانی رئیس دفتر رهبری است. پسرش مجتبی خامنه‌ای با دختر غلامعلی حداد عادل ازدواج کرده‌است.
مصطفی دیگر فرزند وی با دختر عزیزالله خوشوقت ازدواج کرده‌است. مسعود نیز با فرزند محسن خرازی و خواهر صادق خرازی ازدواج کرده‌است.
سید محمد خامنه‌ای، برادر بزرگتر او، عضو مجلس خبرگان قانون اساسی بوده و در حال حاضر ریاست بنیاد حکمت اسلامی صدرا را بر عهده دارد.
برادر کوچکتر وی سید هادی خامنه‌ای نیز روحانی و فعال سیاسی عضو مجمع روحانیون مبارز است که در سال 1379 روزنامه حیات نو را منتشر کرد که این روزنامه به دستور دادگاه ویژه روحانیت توقیف شد.
خواهر وی «بدری حسینی خامنه‌ای» همسر شیخ علی تهرانی بود. علی تهرانی روحانی فعال در دوران انقلاب بود که به مجاهدین خلق گرایید و به عراق پناهنده گشت. او در سال 1374 به همراه خانواده‌اش به ایران بازگشت. همسر او «بدری حسینی خامنه‌ای»، در ایران درگذشت.
برادر کوچکتر او، سید حسن خامنه‌ای، مسئول هیئت‌های رسیدگی به تخلفات اداری وزارت نفت و نماینده وزیر در این هیئت است.
